H によるホスホロジアミデート モルホリノ オリゴヌクレオチド (PMO) の収束合成

Oct 15, 2023

Scientific Reports volume 13、記事番号: 12576 (2023) この記事を引用

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ホスホロジアミデート モルホリノ オリゴヌクレオチド (PMO) は、有望なタイプのアンチセンス オリゴヌクレオチドですが、合成が難しいため入手が困難です。 この研究は、H-ホスホン酸アプローチを使用した PMO の効率的な合成アプローチを示しています。 ホスホニウム型縮合試薬の使用により、現在の合成アプローチと比較してカップリング時間が大幅に短縮されました。 さらに、ホスホニウム型縮合試薬は PMO のフラグメント縮合を促進し、顕著なカップリング効率で 4 つの核酸塩基すべてを含む最大 8 量体を合成しました。 これは、PMO の収束合成に関する最初の報告です。 このアプローチは、PMO の大規模な合成を促進し、次世代の治療法としての PMO の人気と入手しやすさを加速します。

アンチセンスアプローチは、疾患関連遺伝子の発現を制御するための将来の治療法として研究者から注目を集めています1、2、3。 非イオン性ヌクレオチド間結合とモルホリノ骨格を備えたホスホロジアミデート モルホリノ オリゴヌクレオチド (PMO) は、有望なアンチセンス薬と考えられています 4,5。 PMO の標的 mRNA に対する高い結合親和性 4、配列特異性 6、7、水への溶解性 6、および低い毒性 7、8、9、10 は、以前の研究で確認されています。 現在までに、デュシェンヌ型筋ジストロフィーに対する 4 種類のアンチセンス医薬品（Exondys 51®11、Vyondys 53®12、Viltepso®13、Amondys 45®14）が承認されており、今後さらに多くの PMO 医薬品が承認される予定です。 さらに、チオホスホルアミデートモルホリノオリゴヌクレオチド（TMO）と呼ばれる新しい PMO 類似体が合成され、アンチセンス治療における新規薬剤候補としての可能性が示されました 15。 PMO の急速な進歩により、PMO および PMO 類似体の合成のための効率的なアプローチを開発する必要性が高まっています。 特に、PMOを一度に大量に合成できる合成アプローチは、患者がアンチセンス治療を利用できるようにするために必要である。 現在までに、多くの合成アプローチが開発されてきました。 PMO の最初の合成アプローチは、Summerton と Weller によって報告されました 5 (図 1-A)。 このアプローチでは、5'-ヒドロキシ基に N,N-ジメチルアミノクロロホスホルアミデート部分とアミノ基にトリチル (Tr) 基を有するモルホリノ ヌクレオシドをモノマー ユニット (A) として使用しました。 PMO は、モノマー（A）の 5’-N,N-ジメチルアミノクロロホスホルアミデート基の 3’ 末端の Tr 基を除去した後、オリゴマーの 3’ 末端のアミノ基と縮合を繰り返すことにより合成されました5。 このアプローチは広く使用されていますが、モノマーの反応性が低く、縮合反応を完了するまでの反応時間が長いなど、いくつかの問題が認識されています。 2012 年、原川ら。 LiBr を反応混合物に添加することが効果的であり、反応がかなり促進される (約 10 倍の改善) ことを発見しました 16。 さらに、Li ら 17 は、反応温度を 90 °C に上げると縮合反応が 8 分以内に完了し、フローリアクターを使用してわずか 3.5 時間で 18 mer-PMO を合成できることを発見しました。 Kundu et al.18 は、自動オリゴ合成装置を使用した PMO の合成を報告しました。 このレポートでは、Fmoc 化学を使用して 3 量体 PMO の液相合成が達成されました。 さらに、30 mer の PMO を DNA 合成機で合成しました。

PMO 誘導体の合成のための現在のアプローチ。

最近、Langner ら 15 は、ホスホロジアミダイト誘導体をモノマーとして使用して TMO を合成するための新しい合成アプローチを報告しました (図 1-B)。 PMO とは対照的に、TMO にはホスホロチオアミデート結合があり、アンチセンス オリゴヌクレオチドとして有望な特性を示しました。 TMO は、高い RNA 結合親和性と高いヌクレアーゼ安定性を示しました。 さらに、キメラ TMO は、マイクロ RNA 阻害剤としての可能性を示しました。 図 1-B に示すように、このアプローチでは 5’-水酸基 (B) に 4,4’-ジメトキシトリチル (DMTr) 基を有するモルホリノ ホスホロジアミダイト誘導体をモノマー単位として使用します。 合成プロセスには、5-エチルチオ-1H-テトラゾール (ETT) などの酸性活性化剤の存在下で、モルホリノ ホスホロジアミダイト モノマー (B) とオリゴマーの 5' 末端のヒドロキシ基を縮合させ、その後硫化することが含まれます。ホスホラミダイト中間体（Ｃ）。 その後の脱トリチル化とそれに続く合成サイクルの繰り返しにより、TMO が生成されました。 報告されたカップリング収率は 95 ～ 97%、縮合反応時間は 5 分でした15。 このアプローチは TMO の合成には有効ですが、PMO の合成には適用できません。 この方法では中間体としてホスホロアミダイト誘導体(C)が得られますが、この中間体からは所望のPMOのホスホロジアミデート結合が得られません。